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2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 µl体系中使用0.125 µg FITC anti-mouse CD4，0.06 µg APC anti-mouse CD25抗体。最好根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。 3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞（离心并转移）。 4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。 5、避光4℃孵育30分钟到18小时（孵育30分钟到18小时，结果一样）。 6、加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）（1:9去离子水稀释）离心洗涤细胞并弃去上清液。 7、重复第6步操作洗涤细胞。 8、（可选）加入含0.5 µg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液，保证100 µl体系4 ℃孵育15分钟。 9、封闭液无需洗去，体系加入0.5 µg PE antimouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释），避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。 10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。 11、重复上一步洗涤细胞。 用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 |
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以上步骤仅供参考，以厂家说明书为准。 | |
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