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1、制备PBMC，并调整细胞浓度至107/ml。 2、在每个流式上样管中加入100 µl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。 3、按照细胞表面抗原染色方法标记CD4和CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量（一般来说是20ul，可能随批次有差异）。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。4 ℃孵育30 分钟。 4、用预冷PBS溶液洗涤细胞，300 -400 g离心5分钟，去上清。 5、用3倍体积的固定/破膜稀释液 稀释 固定/破膜浓缩液，制成固定/破膜工作液，注意要新鲜配制，每个样本的用量为1ml。 6、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。 7、避光4℃孵育30分钟到60分钟。 8、将破膜缓冲液用去离子水1:9稀释，制成工作液。每个样本的用量为4~5ml。 9、无需洗涤，直接加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）300 -400 g离心洗涤细胞并弃去上清液。 10、（可选）重复第9步操作洗涤细胞。 11、加入100 ul PBS重悬细胞。 12、（封闭可选）体系中加入2%的大鼠血清2 ul，室温避光孵育30分钟。 13、体系加入适量的Foxp3抗体，对照管中加入适量的同型对照，具体用量参照说明书，避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。 14、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。 15、重复上一步洗涤细胞。 16、用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 注：以上说明书仅供参考，具体实验请对照厂商说明书操作。 |
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