产品信息

 

产品名称	产品编号	规格	价格/元
Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina® 双模式RNA建库试剂盒	12252ES08	8 T	3672.00
	12252ES24	24 T	9272.00
	12252ES96	96 T	29772.00

产品描述

 

Hieff NGS^® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina^®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒，包含RN**段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成试剂，以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

运输与保存方法

 

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

注意事项

 

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6. 本产品仅作科研用途！

二、关于接头连接 (Adapter Ligation)

1. 本公司可提供长接头 (Indexed Adapter)试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer for Illumina^® , Set 1~Set 2  (Cat#12414~Cat#12415)。

2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3. 使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4. 建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM，接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表

Input Total RNA	Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

三、关于文库扩增 (Library Amplification)

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2. 如果您使用 Indexed Adapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物 Primer mix 进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用 Index Primers 进行扩增，加上相应的 Index。

3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。

4. 表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求，若您的样本质量较差（如降解严重的FFPE样本），可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意，由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差异较大，实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA	Number of cycles
	Non-stranded	Stranded
10 ng	15	15
100 ng	14	14
500 ng	12	13
1 μg	11	12

【注】：*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关，样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑，选择最合适的建库条件。

四、DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®TUNEology 波长可调检测卡盒