PCR替代技术，RPA全攻略之疑难解答
来源胜创生物www.shengchuangbio.com
摘要 : 重组酶聚合扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
RPA反应需要在怎样的温度下进行?
标准TwistAmp®试剂盒的运行温度在37°C - 42°C之间。温度超过42°C会使酶的活性受到影响。RPA反应在低于37°C的条件下也能进行，不过TwistAmp®试剂盒已经针对反应速度进行了优化，不一定支持超出范围的温度条件。为了获得更好的效果，TwistDx公司推荐用户在40°C下使用于逆转录试剂盒。
RPA反应能实现多重化么?
可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量(nmol)最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。
RPA反应需要在特殊仪器上进行么?
不需要。对TwistAmp®基础试剂盒和nfo试剂盒而言，只要温度能控制在37-42°C之间就行。进行实时监控的体系(如TwistAmp® exo试剂盒)，需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。
RPA反应能对模板进行定量么?
可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。
此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。
扩增产物能在琼脂糖凝胶上分析么?
可以，TwistAmp®基础反应、TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通过跑胶进行终点分析。不过TwistAmp® exo不行，因为该系统里的外切核酸酶会消化扩增子。
扩增反应能进行荧光终点分析么?
可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。
RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么?
支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。
能用插入性染料实时监控RPA么?
可以。插入性染料可以在RPA反应中进行定量和监控。不过，这种染料可以结合任何双链DNA，会生成来自引物的假阳性信号。由于RPA扩增在常温下进行，这种噪音会比PCR严重一些。此外，不推荐把插入性染料用于TwistAmp® exo体系，因为体系中的核酸外切酶会在反应过程中切割扩增产物。
RPA试剂能制成master-mix么?
可以。在进行DNA检测时，可以把重悬缓冲液、引物和探针混合在一起，重悬冻干的RPA pellets。然后将不同DNA加入反应体系，最后用MgAc起始反应。在进行引物筛选时，可以用重悬缓冲液、模板DNA、探针和一个引物制成master-mix，将其分装到1.5 ml小管之后再分别加入不同的引物。注意：只有当两个引物都存在时，才能重悬冻干的RPA pellets，否则重组过程就会有偏向性。
跑胶之前需要回收RPA产物么?
需要。RPA反应中的物质会干扰琼脂糖电泳，如果不进行产物回收，跑出来的带会出现拖尾。
RPA反应的扩增子能保存么?
TwistAmp® Basic或nfo的扩增产物可以保存，短期可以放在4°C，保存时间较长的话建议放在-20°C。
TwistAmp® exo (RT)的扩增产物不能保存。因为扩增停止后如果没有及时失活，外切酶III会快速消化扩增子。
TwistAmp® 基础反应的扩增子能进行TA克隆么?
TwistAmp®基础反应中的聚合酶没有编辑功能，扩增子应该是可以用于TA克隆的。不过TwistDx公司还没有针对这项应用进行过测试。
能直接用标记的探针和TwistAmp®基础试剂盒进行侧流层析检测么?
可以。你可以用两个经过修饰的引物来进行侧流层析检测(LFD)。不过TwistDx公司推荐使用探针和TwistAmp® nfo 试剂盒。这是因为RPA跟PCR差不多，也倾向于形成引物二聚体。如果引物不完美，很容易发生交叉反应，生成假阳性结果。而TwistAmp® nfo体系能够避免这个问题。
在用侧流层析试纸进行检测时需要稀释RPA产物么?
是的。RPA反应中的一些物质会干扰试纸上的抗体，如果不能充分稀释就会出现非特异性结合和假阳性信号。
在TwistAmp® exo (RT)反应即将结束时荧光急剧增强，这正常么?
是正常的。在TwistAmp® exo反应中，聚合酶和核酸外切酶III处于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽，核酸外切酶III开始占据优势，结果导致荧光信号出现剧增。